Nat Comm | 斑马鱼模型揭示RNF170 基因与遗传性痉挛性截瘫新关联

Ca2+ 稳态的改变与许多神经退行性疾病有关。内质网是细胞内主要的钙库，对调节细胞内Ca2+ 浓度起着重要作用。内质网Ca2+ 的释放受1,4,5-三磷酸肌醇（inositol 1，4，5-trisphosphate， IP3）受体（IP3R）调控。如图1，IP3Rs是位于内质网膜上的大型四聚体复合物，由质膜G蛋白偶联受体释放的IP3激活。IP3Rs被激活后Ca2+ 可从内质网外流到细胞质。随后活化的IP3Rs通过ERAD（Endoplasmic Reticulum Associated Degradation）途径降解。ERAD途径的关键组成部分erlin-1和erlin-2（分别由基因ERLIN1和ERLIN2编码）的蛋白复合物，可通过泛素E3连接酶RNF170介导IP3Rs的泛素化，并启动IP3Rs的蛋白酶体降解途径。已有研究表明ERLIN1，ERLIN2基因和编码IP3R神经元亚型的基因ITPR1突变可导致HSP和小脑共济失调。

图1 依赖于RNF170的活化IP3R降解途径及影响该途径的遗传性疾病

图2 鉴定到RNF170双等位基因突变的患者家系图谱

研究者在四个不相关的常染色体隐性HSP患者家系中都检测到了RNF170的突变（图2）。研究人员通过初步分子实验确认了患者A4和C4携带突变的致病性后，采用患者的成纤维细胞进行进一步功能验证，发现RNF170的靶向蛋白IP3R-3含量是对照组的2.2-3.8倍（图3a,b）；在刺激细胞释放IP3 后，对照组细胞中的IP3R-3蛋白随着时间的推移而降解，其含量显著减少，然而患者细胞中的IP3R-3含量未见减少（图3c）。以上结果证明了患者A4和C4携带的RNF170突变通过影响IP3R-3降解的方式导致IP3R-3的积累。

图3 患者成纤维细胞中RNF170功能缺失导致IP3R-3的降解受阻 

神经元是HSP中主要受影响的细胞类型，主要表达IP3R亚基1（IP3R-1）。故研究者利用CRISPR / Cas9技术在神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y上建立RNF170敲除模型。Western-blot结果显示纯合突变组中RNF170蛋白表达缺失，并且IP3R-1蛋白较对照组含量更高，这一现象可通过野生型RNF170的再表达有效缓解（图4）。以上结果表明RNF170功能丧失会引起神经细胞中IP3R-1的积累。

图4 SH-SY5Y细胞模型中RNF170突变对IP3R-3含量的影响

为进一步研究RNF170基因在神经发育过程中的作用，作者将斑马鱼作为研究模型，在斑马鱼中找到了人RNF170同源基因rnf170，并利用MO（morpholino oligonucleotides）技术建立基因敲降模型。敲降组幼鱼出现小眼畸形、小头畸形和运动能力丧失的表型，这与患者的临床表型相匹配。作者又通过神经特异性免疫荧光染色观察到敲降组幼鱼在48 dpf时脑部神经发生（neurogenesis）受损（图5b, c）。以上结果表明rnf170的功能缺失会影响斑马鱼的整体胚胎发育，并导致神经发育受损。

图5 MO敲降rnf170对斑马鱼形态和神经发育的影响

总 结

作者通过一系列功能实验，为本研究中HSP患者家系中观察到的RNF170突变提供了基因功能丧失的致病性证据：1）患者成纤维细胞中RNF170蛋白表达缺失；2）患者成纤维细胞中IP3R-3含量升高及其降解受阻；3）SH-SY5Y神经细胞RNF170敲除模型中IP3R-1的含量升高，并能被野生型RNF170的再表达挽救。进一步的斑马鱼研究观察到rnf170敲降幼鱼表现出神经发育缺陷和运动能力丧失。以上结果都为RNF170基因的功能丧失与HSP表型的关联性提供了证据。

 参考文献：Wagner M , Osborn D P , Gehweiler I , et al. Bi-allelic variants in RNF170 are associated with hereditary spastic paraplegia. Nature Communications (2019).

DOI: 10.1038/s41467-019-12620-9