斑马鱼模型揭示遗传性线粒体疾病新致病机制
2020年11月23日，加州大学旧金山分校Gladstone 研究所Philipp Gut和Eric Verdin课题组、Buck老龄化研究所Birgit Schilling课题组、芬兰赫尔辛基大学Anu Suomalainen课题组合作在Nature Communications上在线发表了题为《SUCLA2 mutations cause global protein succinylation contributing to the pathomechanism of a hereditary mitochondrial disease》的研究论文，提出SUCLA2基因突变导致SCL缺乏，引起细胞内琥珀酰辅酶A积聚，进而引起全面的蛋白质过度酰基化，影响蛋白质的翻译后修饰过程，从而导致线粒体功能损伤的病理机制。此项工作中，研究人员采用斑马鱼模型揭示了SIRT5基因对蛋白琥珀酰化过程的调节作用，这一机制的发现将有助于该疾病治疗方法的开发。
线粒体内多种酰基辅酶A是蛋白质修饰和损伤的重要参与者。琥珀酰辅酶A连接酶（Succinyl-CoA ligase，SCL）缺乏是一种线粒体DNA耗竭综合症（OMIM#612073，#245400），患者表现出脑肌病特征。目前已报导超过20名患者携带SUCLG1（编码SCL α-亚基）突变，50名患者携带SUCLA2（编码ATP-特异性β-亚基）突变。携带SUCLA2突变的患者通常表现为儿童早期进行性脑肌病，包括张力减退、肌张力障碍和感音神经性耳聋。目前，SCL缺乏导致线粒体脑肌病的病理机制仍然未知。
研究者首先分析了携带SUCLA2突变的SCL缺乏患者体内的整体蛋白质琥珀酰化水平（图1）。利用非靶向代谢组学分析患者和对照组的成纤维细胞样本后，发现患者的琥珀酰辅酶 A水平显著上升。同时，SDS-PAGE和western blot结果显示患者的整体蛋白质琥珀酰化程度更高。这一结果表明SCL缺乏导致整体蛋白质过度琥珀酰化。
图1
SCL缺乏导致整体蛋白质过度琥珀酰化
接下来，通过对赖氨酸琥珀酰化靶点的蛋白组学分析，研究者在SUCLA2突变患者样本中检测到了更多的赖氨酸琥珀酰化位点（图2）。GO（Gene Ontology）富集分析显示参与三羧酸循环（Tricarboxylic acid cycle, TCA cycle）的蛋白质赖氨酸琥珀酰化位点富集程度最高，除此之外还包括ATP生物合成、丙酮酸代谢和β-氧化等代谢途径中参与线粒体能量生产的蛋白质。这表明SCL缺乏导致高水平的琥珀酰辅酶A产生，琥珀酰辅酶A又通过赖氨酸琥珀酰化影响不同细胞途径中的蛋白质。
图2
赖氨酸琥珀酰化的蛋白组学分析
研究者还发现SUCLA2突变患者成纤维细胞模型中病理性琥珀酰化的蛋白质与Sirt5缺失小鼠模型中被显著调控的蛋白质大量重叠。为了探究SIRT5是否具有调节蛋白琥珀酰化的功能，研究者利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在斑马鱼上进行了sirt5基因的功能研究。研究者首先建立了SCL缺乏斑马鱼模型（sucla2-/-），在此基础上分别建立sirt5功能缺失模型（sirt5-/-）和功能获得模型Tg(ubi:sirt5)。实验结果显示，仅sirt5功能缺失在幼鱼期不会导致蛋白的过度琥珀酰化，而sirt5和sucla2的共同缺失则会显著增加蛋白琥珀酰化水平，sirt5的功能获得模型可以部分减弱蛋白的过度琥珀酰化程度（图3）。这表明sirt5是病理性蛋白琥珀酰化过程的调节基因。
图3
SCL缺乏斑马鱼模型中，sirt5基因调控整体蛋白质琥珀酰化水平
为了解sirt5基因功能对SCL缺乏斑马鱼模型个体生存的影响，研究者测定了幼鱼的耗氧率（Oxygen consumption rate, OCR），发现sirt5基因过表达不能恢复线粒体DNA含量，但可显著提高sucla2缺失斑马鱼的OCR，并提高存活率（图4）。
图4
SCL缺乏斑马鱼模型中，sirt5基因过表达可恢复幼鱼氧化代谢水平并提高存活率
综上所述，琥珀酰辅酶A在携带SUCLA2突变的SCL缺乏患者的细胞中积累，导致整体蛋白质的过度琥珀酰化，而sirt5功能增益可明显缓解SCL缺乏斑马鱼的蛋白过度琥珀酰化，恢复氧化代谢水平，提高整体生存率。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-020-19743-4