AJHG | DYNC1I2 双等位基因变异导致小头畸形综合征
2019年6月6日，瑞士日内瓦大学Stylianos E. Antonarakis课题组及美国杜克大学Erica E. Davis课题组在The American Journal of Human Genetics 杂志上联合发表了名为 “Bi-allelic Variants in DYNC1I2 Cause Syndromic Microcephaly with Intellectual Disability, Cerebral Malformations, and Dysmorphic Facial Features” 的研究报告。该报告通过对三个患者家系的WES数据分析及斑马鱼模型上的功能验证，指出DYNC1I2功能障碍可能导致常染色体隐性小头畸形综合征，并进一步突出了细胞质动力蛋白复合物在神经发育中的关键作用。此项工作中，作者采用CRISPANT技术建立斑马鱼同源基因移码突变模型，并建立morpholino基因敲降模型来同步进行验证，通过对形态学、细胞凋亡及细胞周期的研究，推测细胞凋亡的增加是由于异常纺锤体形态导致的有丝分裂时间延长所致，这为小头畸形的细胞基础提供了思路，同时也建立了DYNC1I2基因与小头畸形综合征的新关联。
细胞质动力蛋白1（cytoplasmic dynein-1），又称细胞质动力蛋白，主要参与细胞质微管网络内物质的逆向运输；细胞质动力蛋白2（cytoplasmic dynein-2），又称鞭毛内运输动力蛋白，主要参与纤毛和鞭毛内物质的逆向运输。人细胞质动力蛋白-1复合物是由DYNC1H1编码的力生成重链，DYNC1I1 和DYNC1I2 基因编码的中间链，DYNC1LI1 DYNC1LI2基因编码的轻中间链，以及DYNLRB1、DYNLRB2、DYNLL1、DYNLL2、DYNLT1和DYNLT3六个基因编码的三类轻链组成。尽管大部分细胞质动力蛋白-1复合物的蛋白亚基尚未与人类疾病关联，近年来已有文章报道其在神经发育与稳态中的关键作用。
本项工作中，作者首先对来自三个独立家系的五个个体进行了全外显子测序及染色体微阵列分析，分别筛选出DYNC1I2基因c.607 + 1G> A的纯合剪接位点突变（家系一），c.740A> G（p.Tyr247Cys）/2q31.1 区域374kb缺失的复合杂合突变（家系二）及c.740A> G（p.Tyr247Cys）/c.868C> T（p.Gln290*）的复合杂合突变（家系三）。所有的患者临床表型均出现小头畸形、身材矮小、面部畸形、胼胝体发育不全或缺失，另外，三号家系患者表型伴有癫痫发作（如图1所示）。2号家庭及3号家庭均出现的错义突变c.740A> G（p.Tyr247Cys）为罕见的杂合突变，在本报告中作为重点研究对象。
图1 DYNC1I2基因患者家系信息和临床表型
为研究错义突变c.740A> G（p.Tyr247Cys）可能导致的蛋白质结构变化，作者对DYNC1I2蛋白结构进行评估，发现p.Try247位于DYNC1I2蛋白N端螺旋后的连接处，而该连接处指向N端附近的第一个WD40结构域（如图2所示）。WD40结构域通常在不同复合物中起到结构作用，在DYNC1I2蛋白中，WD40结构域具有催化重链的功能，并与轻链一起为动力蛋白提供能量。作者进而推测错义突变c.740A> G（p.Tyr247Cys）可能导致DYNC1I2蛋白结构发生改变，从而破坏动力蛋白中间链与轻链间的相互作用，并可能间接地影响动力蛋白重链和该复合物中的其他分子。
图2 DYNC1I2蛋白结构图
作者为了探究DYNC1I2基因与小头畸形综合征之间的关联，在-1.4 col1a1:egfp转基因斑马鱼品系（绿色荧光标记斑马鱼骨骼）上建立了鱼源基因（dync1i2a/dync1i2b）CRISPANT模型 (F0 CRISPR)。研究发现dync1i2a CRISPANT 胚胎与野生型胚胎相比，头部尺寸明显减小，角舌软骨角度明显增大（如图3所示），而dync1i2b CRISPANT没有观察到异常表型。
图3 斑马鱼dync1i2a敲除模型显示神经解剖和颅面缺陷
作者继而在-1.4 col1a1:egfp转基因斑马鱼上建立了MO 敲降模型（分别靶向Exon2、Exon5）。研究发现dync1i2a MO 斑马鱼与CRISPANT 模型出现的表型一致（如图4所示），而dync1i2b MO斑马鱼依然没有观察到异常表型。
图4 斑马鱼dync1i2a MO模型表型数据量化图
为了验证错义突变c.740A> G（p.Tyr247Cys）的致病性，作者采用表达量更高的另一转录本（对应位点c.662 A>G [p.Tyr221Cys]）进行MO 斑马鱼挽救实验，后续实验均采用此转录本。同时使用来自gnomAD数据库的最常见变体p.Pro490Ala mRNA作为阴性对照，p.Gln264* mRNA作为阳性对照。结果发现，WT mRNA可以起到挽救表型的作用，但p.Tyr221Cys患者mRNA却不能挽救（如图5所示）。这一结果说明了该错义突变p.Tyr221Cys可能损害了DYNC1I2蛋白质功能。
图5 斑马鱼dync1i2a MO模型表型挽救实验
为了进一步研究由DYNC1I2基因缺失引起的神经表型，作者通过对dync1i2a MO模型进行免疫染色标记神经元的轴突束，观察到突变体斑马鱼穿过背中线的轴突束及两侧神经元显著减少，并且该表型通过注射WT mRNA可以得到挽救（如图6所示）。
图6 斑马鱼dync1i2a MO模型免疫染色及挽救实验
作者想证实dync1i2a MO斑马鱼的小头表型是否和其他小头畸形模型一样，是由细胞凋亡所引起。接下来作者进行了TUNEL染色实验，发现MO模型细胞凋亡数量明显多于对照组，且通过注射WT mRNA可以得到挽救。作者猜测dync1i2a缺失引起的细胞凋亡可能与细胞周期进程相关，进而用PH3免疫染色监测经历G2/M期转变的细胞。与TUNEL染色结果相似，作者观察到MO斑马鱼中PH3染色的细胞显着增加，并且该表型同样可以被WT mRNA挽救（如图7所示），这一结果表明dync1i2a基因的破坏会导致细胞周期进程缺陷。
接下来作者利用dync1i2a MO模型对有丝分裂过程中纺锤体的形态进行研究，研究发现在有丝分裂前期和中期，MO斑马鱼中纺锤体形态异常的细胞数量显著增加，且在有丝分裂后期的细胞中存在更明显的差异（如图7所示）。因此作者推测dync1i2a 的缺失引起有丝分裂纺锤体异常，导致细胞周期延迟，进而引起细胞凋亡。
图7 dync1i2a 敲降对细胞凋亡、细胞周期进程以及有丝分裂纺锤体组织的影响
本项工作建立了DYNC1I2基因与小头畸形综合征之间的关联，将DYNC1I2加入到脊椎动物大脑正常发育相关的重要基因列表中。遗传学和功能研究的结果凸显了动力蛋白-1复合体通过组织有丝分裂纺锤体调控细胞周期在神经发育中的重要性。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2019.04.002
赛福基因现已开展“功能验证”服务，欢迎添加客服微信了解详情。
微信扫描/长按识别二维码：
