AJHG | SEMA6B末端外显子截短突变导致进行性肌阵挛癫痫

新发突变 （De Novo Variants, DNVs） 可导致许多遗传性疾病。全外显子测序（WES）分析发现致病性DNVs往往聚集在一些特定区域, 其中一个区域是基因最后一个外显子及倒数第二个外显子的最后50bp。该区域发生的截短DNVs会逃逸无意义介导的mRNA降解，于是将该区域称为NMD（-）。这类突变可能会导致显性负效或功能获得效应。

作者首先收集了截短DNVs在每个基因NMD（-）区域内的发生概率，并结合346例发育性癫痫性脑病（DEE）患者家系的WES数据，进行了截短DNVs在NMD（-）区域的富集分析。结果显示截短DNVs在SEMA6B基因中显著富集。通过对346例患者家系的初始分析，加上对患有DEE和发育障碍的1,406和4,293个独立个体的进一步筛查，作者在来自不相关家庭的5位患者中发现了位于SEMA6B基因NMD（-）区域的4个截短DNVs。这5名患者都表现出持续的进行性肌阵挛性癫痫，具体表现为不能正常行走和正常说话、轻度的小脑萎缩、肌阵挛、癫痫发作和进行性神经功能减退等。这4个突变都位于SEMA6B基因的最后一个外显子上，从而导致细胞内结构域 （ICD） 的截短（图1）。

图1 DNVs位于SEMA6B基因NMD（-）区域的患者家系信息和突变位点分布

为了确定SEMA6B基因NMD（-）区域的截短突变是否影响神经系统功能，作者建立了斑马鱼模型来进行突变影响的研究。作者采用CRISPANT技术对斑马鱼同源基因sema6ba和sama6bb进行基因编辑，分别在2号外显子和17号外显子（最后一个外显子）上设计crRNA来引入突变, 建立F0代嵌合模型crispant来进行表型观察。作者在受精后24小时 （24 hpf） 对斑马鱼胚胎进行明场显微镜观察，并使用乙酰化微管蛋白染色（轴突标记物）对中枢神经系统（CNS）进行荧光成像和神经结构的测量。结果显示sema6ba和sema6bb 基因F0代crispant表现出整体发育缺陷和CNS结构异常（图2），并且17号外显子突变组相较2号外显子突变组表型更为严重。这一结果表明斑马鱼模型能很好地再现人类患者的相关表型，并模拟末端外显子NMD（-）区域截短突变的致病机制。

图2 斑马鱼sema6ba/b基因末端外显子的破坏导致严重的发育及中枢神经系统缺陷

由于SEMA6B基因在抑制性（GABAergic）神经元中有较高表达，因此该基因功能的破坏将有可能导致癫痫发生。为验证这一假设，作者在斑马鱼模型上进行了促癫痫药物戊四氮（PTZ）敏感性测试。作者使用不同浓度的PTZ处理受精后7天（7 dpf）crispant幼鱼及未注射对照组，通过运动轨迹跟踪，测量了PTZ暴露后幼鱼的总游动距离。作者观察发现PTZ处理会增加幼鱼的游动行为（阶段I），导致快速的“漩涡”运动（阶段II），或导致1-3s的阵挛式发作（阶段III）和活动丧失（图3）。量化结果显示对照组和crispant组的幼鱼总游动距离以剂量依赖的方式增加，但相比对照组，crispant幼鱼对PTZ的敏感性增加，特别是在低浓度PTZ条件下crispant幼鱼更容易表现出阶段III类似阵挛的行为，并且17号外显子突变组相较2号外显子突变组表型更为显著。这一结果表明在PTZ影响下斑马鱼sema6ba和sema6bb基因末端外显子突变更容易导致癫痫发生，这为SEMA6B基因NMD（-）区域截短突变与癫痫表型的关联提供了证据。

图3 PTZ影响下sema6ba和sema6bb crispant更容易发生癫痫行为

在本研究中，作者发现（1）DEE患者群体中，DNVs在SEMA6B基因的NMD（-）区域有很强的富集；（2）SEMA6B同源基因末端外显子截短突变的斑马鱼crispant模型表现出神经系统结构异常，并且在PTZ影响下更容易产生癫痫行为。作者进而指出SEMA6B基因最后一个外显子上的截短突变是导致进行性肌阵挛癫痫的遗传原因。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2020.02.011